Фиксация нуклеиновых кислот. Демаскирование нуклеиновых кислот (Обзор литературы провел резидент КазНМУ Гасанов А.)

Фиксация нуклеиновых кислот.
Демаскирование нуклеиновых кислот

Обзор литературы провел резидент КазНМУ Гасанов А.

Для неизотопной гибридизации in situ с одинаковым успехом можно использовать препараты, приготовленные любым из упомянутых выше способов. Процедура фиксации, применимая для всех этих препаратов, описана в протоколе. Для фиксации последовательно используют МУК и параформальдегид, поскольку:

а) фиксация в МУК увеличивает клеточный объем и улучшает сохранность нуклеиновых кислот;

б) фиксация альдегидом повышает устойчивость клеток к нагреванию, способствует сохранности морфологии и позволяет проводить денатурацию при более высокой температуре;

в) альдегидная фиксация повышает чувствительность метода;

г) препараты перед гибридизацией подвергаются одинаковой обработке, что позволяет использовать стандартные процедуры гибридизации и детекции.

В некоторых случаях, например при работе с очищенными препаратами, в которых последовательность-мишень содержится в достаточно большом количестве, эти факторы несущественны, и достаточно фиксировать клетки в МУК в соответствии с протоколом. Дальнейшая предварительная обработка клеток необязательна и следует сразу же переходить к протоколу. Иногда (например, при гибридизации in situ с метафазными хромосомами) любая предобработка препаратов только ухудшает результаты.

Демаскирование нуклеиновых кислот

После фиксации клеток в альдегиде необходимо демаскировать нуклеиновые кислоты с помощью частичного протеолиза. Как показывает наш опыт, лучше всего использовать для этого протеиназу К в низкой концентрации, хотя вполне пригодны и другие ферменты, например пепсин. Протеолиз - очень важный этап, поэтому необходимо тщательно контролировать концентрацию ферментов и проверять активность каждой партии на контрольной системе.

Подготовленные таким образом препараты можно непосредственно использовать для гибридизации in situ, однако в некоторых случаях (в частности, при работе с мазками шейки матки, полученными рутинным способом) приходится проводить постфиксацию препаратов параформальдегидом, чтобы уменьшить потери клеточного материала.

Фиксация препаратов и демаскирование нуклеиновых кислот

Материалы

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ): 10 мМ фосфат, 150 мМ NaCl, рН 7,2

ФСБ/глицин: 0,2% (в/о) глицин в ФСБ

Метанол: уксусная кислота (3:1, о/о)

4% (в/о) параформальдегид: растворяют 4 г параформальдегида (BDH) в 100 мл ФСБ, нагрев его до кипения в конической колбе с отливной воронкой. Все работы проводят в вытяжном шкафу. Охлаждают раствор во льду.